周昌谷对传统笔墨技法深有研究，尝潜心学习八大、石涛、徐青藤、方方壶、吴昌硕、黄宾虹等人作品，并赴敦煌临摹壁画。又对西方印象派、野兽派色彩亦有所汲取。善于兼容并蓄，融会贯通，将传统花鸟画用笔移植于人物画中，用色和运墨也极见匠心。其画多以少数民族生活为题，注重表现蕴藏在平常生活中的诗情画意，富有韵味，代表作《两个羊羔》荣获第五届世界青年联欢节金质奖章。其草书、篆刻也有精深造诣。周昌谷是现代浙派人物画代表人物之一。

周昌谷在国立杭州艺专读书时期，学校偏重素描、水彩、人体等等，因此他当时很想成为一个素描家，画油画，一心想到外国去看看。然而，1954年周昌谷有幸参加考察团赴敦煌临摹，也正是这趟敦煌之行让他思想上发生了转变，决心放弃画油画，主攻中国画。

周昌谷与李震坚、方增先、顾生岳、宋忠元等为新中国第一代现代中国人物画名家，他们共同开创的浙派人物画在全国影响很大，并成功创建了现代中国画人物画的教学新体系。